qPCR又称定量PCR，主要在核酸水平上对目标核酸进行检测和定量分析。主要原理是以PCR反应生长动力学曲线为参考，进行比较分析，得到特定检测对象是否存在，以及其含量相对于内参对照的倍数。
qPCR可以在核酸水平上检测所有靶标，如病、微生物、细菌、真菌、植物或动物特异性基因DNA，或相关DNA表达转录的RNA或以RNA形式存在的病等。已成为快速检测COVID-19点的主要技术手段。
一、分子鉴定技术的发展历史是怎样的？
分子诊断技术是指以DNA、RNA为诊断材料，利用分子生物学技术检测基因是否存在、缺陷或异常表达，以诊断人体状况和疾病的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否发生变化、数量以及表达功能是否异常，从而在基因水平上判断受试者是否出现异常变化，对于预防、预防、治疗具有重要意义。疾病的预测、诊断、治疗和预后。简单来说，一切基于分子生物学水平的方法学技术都是分子诊断技术，如PCR技术、基因测序技术等。
PCR技术，或称聚合酶链式反应，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。其基本原理与DNA的自然复制过程类似，由三个基本反应步骤组成变性-退火-延伸。模板DNA的变性、模板DNA和引物的退火和复性以及引物的延伸。通过重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以获得更多的“半保留复制链”，这条新链可以成为下一个循环的模板。完成每个循环需要2至4分钟，待扩增的目的基因可在2至3小时内扩增数百万倍。这个想法最早由美国的Mullis于1983年提出。1985年，他发明了聚合酶链式反应，一种简单的DNA扩增方法，这意味着PCR技术的真正诞生。简单来说，PCR技术本质上是扩增DNA片段，通过实时荧光PCR技术可以检测样本中的DNA含量。
基因测序技术是确定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA序列分析是进一步研究和修饰目标基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等人发明的双脱氧链末端终止法。以及Maxam和Gilbert发明的化学降解法。这两种方法在原理上有很大不同，但都是基于核苷酸从固定点开始并随机以特定碱基结束，产生四组不同长度的A、T、C和G。然后通过尿素变性PAGE凝胶电泳检测以获得DNA序列。目前，桑格测序法已得到广泛应用。简单来说，基因测序技术就是对DNA片段进行测序分析，使DNA序列清晰。
我们来回顾一下近50年来分子诊断技术的发展历程
1.基于分子杂交的分子诊断技术
20世纪60年代到80年代是分子杂交技术发展最快的20年。由于当时无法人工扩增样本中的目标基因，人们只能通过已知基因序列的探针捕获并检测目标序列。其中，液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术和人工合成cDNA探针的出现，为基于分子杂交的体外诊断方法提供了初步的技术储备。
-1。Southernblot技术-Southernblot，
Southern[1]于1975年发明了Southern印迹技术。它通过性内切酶将DNA片段化，利用凝胶电泳分离不同长度的DNA片段，并通过虹吸或电压转移将其转移到醋酸纤维素膜上。然后使膜上的DNA变性，并与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交。洗脱后，使用放射自显影技术来鉴定待测DNA片段与探针之间的同源序列。该方法同时进行DNA片段酶切和分子探针杂交，确保了检测的特异性。因此，它一经推出，就成为探针杂交领域最经典的分子检测方法。广泛应用于各种基因突变，如缺失、插入、易位等，以及性片段长度多态性——性片段长度多态性。RFLP，识别正在进行中。阿尔文等人。[2]于1977年推出了基于转移杂交的Northernblot技术，这也成为当时RNA检测的金标准。
-2。ASO反向斑点印迹-等位基因特异性寡核苷酸反向印迹，ASO-RDB，
利用核酸印迹技术对核酸序列进行杂交检测，具有极高的特异性，但存在操作极其繁琐、检测时间长的缺点。1980年建立的样本点样固定技术，摆脱了传统Southern印迹需要通过凝胶分离技术固定样本的缺点。通过将单碱基突变引入质粒载体，构建了第一个等位基因特异性寡核苷酸探针-等位基因特异性寡核苷酸ASO，使得检测核酸序列中的点突变成为可能。1986年，Saiki等[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO点杂交的高特异性结合起来，实现了利用ASO探针对特异性基因多态性进行分型。后来，为了完成同一样本中多个分子标记的高通量检测，Saiki[4]发明了ASO-RDB，将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定在膜上的探针杂交。显色、基因分型和基因突变检测。该方法可以将多种寡核苷酸探针固定在同一个膜条上，仅通过一次杂交反应就可以筛选待测样品DNA的数十个甚至数百个等位基因。由于其操作简便、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型和病原体筛查最常用的技术。
-3。荧光原位杂交-荧光原位杂交，FISH，
FISH起源于核素标记原位杂交技术。1977年，Rudkin[5]首次利用荧光素标记探针完成了原位杂交尝试。20世纪80年代和90年代，细胞遗传学和非同位素标记技术的发展推动FISH在临床诊断中的实际应用。与其他仅检测核酸序列的分子诊断技术相比，FISH结合了探针的高特异性和组织学定位的优势，可以检测并定位完整细胞或分离染色体中特定的正常或异常DNA序列；由于使用高能荧光素标记DNA探针，可以使用多个荧光素标记同时检测多个目标。
如今，FISH已广泛应用于核型分析、基因扩增、基因重排、病原微生物鉴定等多个方面。通过比较基因组杂交-comparativegenomichybridization，CGH，以及光谱核型分析-spectralkaryotyping，SKY等源自FISH的技术，正在越来越多的临床诊断领域发挥作用。
-4。多重连接探针扩增技术-多重连接依赖性探针扩增，MLPA，
MLPA技术最早由Schouten等人报道。[6]2002年。每个MLPA探针包含两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个是化学合成的，一个是通过M13噬菌体衍生方法制备的；每个探针包括引物序列和特定序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列杂交，然后使用连接酶连接两个探针。连接反应具有高度特异性。只有当两个探针与目标序列完全杂交时，连接酶才能将两个探针连接成完整的核酸单链；反之，如果目标序列和探针序列不完全互补，即使只有一个碱基差异也会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，使用一对荧光标记的通用引物来扩增连接的探针。每个探针的扩增产物的长度是唯一的。最后通过毛细管电泳分离扩增产物，即可检测核酸序列。由于巧妙借用了扩增探针的原理，MLPA技术可以在一次反应中识别多达45个目标序列的拷贝数。
该技术具有探针连接反应的特异性和多重扩增探针杂交的高通量特点。经过MRC-Holland十余年的发展，MLPA技术已成为涵盖多种遗传病诊断、药物遗传学多基因位点鉴定、肿相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度量化的综合性分子诊断系统。是目前临床最常用的高通量检测已知序列变异和基因拷贝数变异的方法。
-5。生物芯片
1991年，Affymetrix公司的Fordor[7]利用其开发的光刻技术制备出了第一个以载玻片为载体的微阵列，标志着生物芯片正式成为实用的分子生物学技术。如今，芯片技术已经取得了长足的进步。如果按照结构来分类，基本上可以分为两种类型基于微阵列的混合芯片和基于微流控的反应芯片。
1-微阵列芯片
-1。固相芯片微阵列基因组DNA分析-基于微阵列的基因组DNA分析，MGDP，芯片将微阵列技术应用于MGDP检测已有十多年的历史。其技术主要分为两类，即微阵列比较基因组杂交阵列-基于阵列的比较基因组杂交（aCGH）和基因型杂交阵列-SNParray。顾名思义，aCGH芯片通过测试DNA和参考DNA的双色比较来显示两者之间拷贝数变异（CNV）的变化，而单核苷酸多态性（SNP）芯片则不需要与参考进行比较。对DNA进行比对，通过杂交信号强度直接显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步，目前市场上可以同时检测SNP和CNV的高分辨率混合基因芯片芯片已经上市。MGDP芯片主要用于发育迟缓、先天异常等儿童遗传病的辅助诊断和产前筛查。经验证，利用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100[8]。表达谱芯片-基因表达谱阵列，GEParray，1999年，Duggan等人。[9]首次利用cDNA芯片绘制mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益受到关注，microRNA芯片、长链非编码RNA、lncRNA、芯片等也随之出现。与MGDP芯片类似，GEP芯片利用反转录后生成的cDNA文库与固定在芯片载体上的核酸探针杂交，检测杂交荧光信号的强度，从而确定基因的表达量。与基因组杂交相比，GEP芯片检测到的转录组信息具有更重要的生物学意义，对于疾病的诊断和预后具有特殊意义。目前，GEP芯片已用于急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征等血液系统疾病和神经退行性疾病的诊断、分类和预后评估，并取得了满意的效果；
-2。液相芯片传统的固相芯片将检测探针锚定在固相载体上以捕获目标序列，而Luminex的xMAP技术[10]将两种红色荧光染料以不同比例结合在一起，以结合聚苯乙二醇。将乙烯微标记上不同的荧光颜色并进行编码，得到具有数百种荧光数的微。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联到编码微上，从而通过微编码来区分不同的探针。混合的探针-微复合物与待测样品杂交，微在流动的鞘液驱动下通过红绿双色流式细胞仪。红色激光检测微编码，绿色荧光检测杂交通过测量核酸探针上荧光报告基团的信号强度，可以一次性完成单个样品中多个目标序列的同时识别。目前，该技术已广泛应用于囊性纤维化等遗传性疾病的诊断、多种呼吸道病的鉴定、人乳头病的分型等。
2-微流控芯片
1992年，哈里森等人。文献[11]首次提出将毛细管电泳和进样设备集成到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的概念。通过分析设备的小型化、集成化，完成了传统的分析实验室。芯片实验室的转变。微流控芯片——microfluidicchip，由微米级流体管道、反应器等部件组成。与宏观尺寸的分析装置相比，其结构大大增加了流体环境的面积/体积比，以最大限度地利用液体和物体。与表面相关的特殊性质包括层流效应、毛细管效应、快速热传导和扩散效应，使得进样、预处理、分子生物学反应、检测等一系列实验过程可以在一块芯片上完成。
目前，利用微流控芯片并行检测多个基因位点来指导用药是主要的临床应用领域。
2.核酸序列测定
测序反应是直接获取核酸序列信息的唯一技术手段，是分子诊断技术的重要分支。尽管分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术近年来取得了长足的进步，但其对核酸的鉴定仅依赖于间接推断的假设。
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